Kasvien Kudosviljely (micropropagation&Plant tissue culture)

[Esine69]

Ajattelin herättää henkiin vanhan tekstini minkä kirjoitin vuosia sitten englanniksi. Jakaa tietoni ja taitoni.
En jaksa kirjoittaa sitä suomeksi enään. I hope y´all can read english. On kyllä pitkä teksti ja hankalia sanoja jos ei oo enkku hallussa.

(SE ON SUOMENNETTUNA MUUTAMA VIESTI ALEMPANA)

Harrastin joskus kasvien mikrolisäystä ja ajattelin että miksi en kokeilisi joku päivä chilien kanssa sitä.
En ole moneen vuoteen tehnyt kokeita mutta edelleen materiaalit ja useita kasvihormoneja on kaapissa jemmassa.
Tuli vaan mieleen että voisin joskus laittaa kokeet pystyyn ja alkaa tutkimaan miten nuo chilit lisääntyy koeputkessa ja miten saan tehtyä erikoisia chilejä.
Meinaan voisi saada jonkun hybridihirviön aikaiseksi. Kunhan vaan jaksaisi perehtyä uudestaan. Voisin sitten jakaa tietoa ja koetuloksia täällä.
Jos on kiinnostuneita niin voisin todella alkaa panostaan asiaan enemmän. Tää on kyllä sitten sellaista hitec hifistelyä että monelta loppuu hermo kesken.
Olisi kiva keskustella asiasta suomeksi kun aina englantilaisilla sivuilla pääasiassa kirjoitellut ja jakaa tietoa ja taitoja.
Elikkä tässä tulee teksti.


TISSUE CULTURE and also called micropropagation

This is a my tutorial of tissue culture. Tissue culture is the technique to grow a new plant of little piece of the plant. It can be a very small piece plant or pollen. If you must grow it from a little piece of plant ,example 1mm *1mm then you have first grow callus and the callus is a multiple cell division and it´s looks like lump of green and pale yellow blob. Callus cells are those cells that cover a plant wound. Those cells are undifferentiated cells and you can grow a new plants of that. They called a explants. Firs you have grow callus and move to a different media and then you can grow multiple explants of it. That is cloning a plant.
If you have a piece of stem then you can stick straight on a media and then the stem will growth a multiple stems on it. That it called "shoot" you need in stem a meristems and those are things when the branch divided or growing a leafs and buds. Specifically, an active apical meristem lays down a growing root or shoot behind itself, pushing itself forward. Apical meristems are very small. 
In a last year i was interested of tissue culture and order my plant hormone and growth media from http://www.hometissueculture.org/ and those pages is good information and kits to order. It´s good start in there. Nowadays I order from ebay my plant hormones and growth media and it cheaper that way .But I haven´t yet test it. Is they a good for tissue culture? Let´s wait and see! 
Usually the growth media contain Gelling agent and I use pure agar for it. And It´s contain sugars, vitamins and plant hormones such like kinetin and Indole-3-butyric acid(IBA). There are a three basic hormone group , Those are Auxins, Cytokinins and Gibberellins.

Auxins produce roots basically, it´s good for a cuttings. Too much of this will kill your plants. Usually you use auxsin like this, indole-3-acetic acid (IAA)(can make DMT from this), indole-3-butyric acid(IBA), 1-naphthaleneacetic acid(NAA) And this is unusually used phenylacetic acid (PAA) you dont can´t find this because you can make meth from it. It´s banned in many country or you must have a company who use such chemicals. You need auxins for cell division. Auxins and cytokinins are present in equal levels you can make callus.

Cytokinins are the things you use cloning that promote cell division, roots and shoots. And it´s crucial componet for growing callus and you need it for everything. There are cytokinins like this, Kinetin, Zeatin and 6-benzylaminopurine (BAP). Zeatins are too much for my pocket, but they are powerful that normal cytokinins.  Stem cloning or plantlets growing ratio of cytokinins and auxins are the cytokinins are the leading hormone.

Gibberellins regulate growth and influence various developmental processes, including stem elongation, germination, dormancy, flowering, sex expression, enzyme induction, and leaf and fruit senescence. Gibberellins are good for germination and you can germinate seeds that is hard to germinate. percentage point is greater than typically. You can raise the seed germination from 20% to 80% , but you have to find good ratio of gibberellins PPM(parts-per-million) and water .  I use Ga3 for seed germination only and i don´t use in growth media. I Only diluted in water and soak seeds in there 10-30minute. And i have use IPA (Isopropyl alcohol) to dissolve Ga3. You need your IPA to be 70%-90% even pure to dilute Gibberellins, Then you can dissolve in water. I use usually 300-3000PPM ratio but it have to find good ratio for every type of plant. I think you have dissolve every plant hormone fist in 70% (or purer) IPA or another alcohol if is a powder and then you can mix with water.
There are a how many more hormones and growth regulators such i don´t need mention and i don´t use.

Now in the growth media . You need sugars in your media and you can use sucrose, dextrose, fructose and I think it can use glucose. Plants need Carbohydrates to grow . I use plain sugar (sucrose). Usually i use in a liter 20-60grams of sugar. I Used 20grams sugar in pereskiopsis and salvia.

Solid media are generally composed of inorganic salts plus a few organic nutrients, vitamins. I buy Murashige and Skoog basal medium with vitamins and there are the nutrients and vitamins what I need. There are several ready made-up compounds what you can buy. You can make your self if you don´t what to buy it. You can use magnesium pills and inositol pills(Vitamin B) and thiamine (Vitamin b1). You can start there but i think it´s better to put all nutrient in media. There are Macro-and Micronutrients, Macronutrients are C, H ,O ,P ,K ,N ,S ,Ca ,Mg( required content in the plant- 0.1%or%per dry weight). Micronutrients are Fe, Mn, Zn, Cu, B, CL, Mo (reguiment-ppm/dry weight) Some plants need Na, Se and Si.

Lets speak of gelling agents, there are agar agar that is a usual used stuff but there are others gelling agent that used. Agarose, carrageenan and gellan gum. Agar is a good stuff but you don´t want to use that what is in your local Chinese or Japanese shop or your markets because it´s not pure agar And you need pure. If is´n pure there are lot of things what you don´t want in the media. Something can fuck up your media. Too high Ph or low and Minerals what you don´t want. So turn your chemical supplier or order from internet. Ebay is good. But i have ripped off on ebay when i order pure 100% agar. I never got my product from there. I lost my money! So i think there are a few good online shops in net where you can order. Usually you use 6-9 grams of agar in the liter of media then you get it firm and gelly. When you use lower amount of agar then you can do liquid technique. I don´t know nothing about of it. I never have a acquainted at that.  But you need the media to be firm and jelly if you stick the piece of stem in it . 
Ph. must regulated and every plant have a own ph. where they like to live. So you must find it or try it , but usually its little bit of acid or neutral.  5-7 ph.

Next thing is very important. You must to do everything in a sterile place and sterile equipments. You must be sure of chemicals at they are sterile.  You have clean every surface whit bleach or alcohol 70%( ethanol or isopropanol) Or purer. Bleach usually comes 5% and i think is a good for cleaning surfaces. You need milder bleach if you using to sterilizing plants. Below 1 % is good to clean plants and you have stirred it to 5-20 min. Then you rinse it in distilled water and then you put the piece of plant in the 70% alcohol in a few minutes. Then rinse three times of distilled water. You have to figure out how long you can disinfect the plant your are using .Trial and error. Some plants are durable and some plant don´t handle too much bleach or alcohol. Try to get the piece of a plant from cleanest place and newest growth. Try to keep the plant in a one peace when the cleansing project happened and then you can cut it for suitable pieces.

Materials what you need in this project is easy to obtain and does not cost too much. Things you need :
Scalpel, long Tweezers, Baby food jars(or tissue culture jars), Plastic caps( transparent), plates, Pressure cooker(or autoclaves), Aquarium (terrarium or transparent plastic box), Micropore tape (or breathing tape), Glove box (or laminar flow hood), Breathe masks( dust mask), Plastic bottles (glass bottles), Measuring cups (measuring glass), Syringes 1ml,2ml,10ml,50ml, Ph-meter (Ph-paper), Fluorescent lamp(natural light), Kettle, Automatic timer(optional), camping burner (alcohol lamp), Heat mat(optional), Thermometer,

Chemicals you need:
Bleach 5%, 70-99% Alcohol (Ethanol,IPA), Hydrochloric acid (Muriatic acid), potassium hydroxide (KOH)(Sodium hydroxide NaOh), 100%Agar, Sugar (sucrose, dextrose, fructose & glucose), Plant hormones(Kinetin,BAP,NAA,IBA),  Murashige and Skoog basal medium with vitamins (Or another medium), distilled water (sterilized, PPM(optional) Muriatic acid you can change acetic acid. 

Now is the basics have learned . Next we do the media example for pereskiopsis spatula. Work with salvia too. I don´t know is it a best formula but i have a succeed. First you take liter distilled water and stick the ½ Murashige and Skoog basal medium with vitamins. This is the place to put the agar and the hormones in the kettle. But I put the agar only and it is a 6grams per liter. Next you check the ph. You can use ph-paper or a ph-meter. I modify ph whit the potassium hydroxide (KOH) or Hydrochloric acid (Muriatic acid). Acetic acid is good for this and safer. NaOh (lye) is good as well. Be careful whit them. You can burn your skin or turn in to a soap . Yo gonna fuck up your sight seen if you spill the stuff in your eyes. Ok. Right now I put the ph. on 5.6.
Then put the stove on and let water to gentle boil. I usually let the mixture boil 5-10min low temperature.  Next step is a divide the mixture in a ten 100ml portions , this is not must. You can do all in a one portion but I want to different concentration of plant hormone. So I take 100ml in flask and the take a syringe and suck the plant hormone what i want. Then push the piston down and I shake the mixture and divide in a three babyfood jars, I use 50ml syringe in this, it´s help a lot. Approximately 33ml per jar and put the plastic cap on and when you have done all of this, you put all jars in the pressure cooker for a 15minute. Sterilize all the media. Let it chill of before you put anything in the jar. I do a usually ten different concentration of mixture of plant hormones. I have seen that is a good thing to do and you see what compound is a best. I have seen the best is the where are kinetin and 6-benzylaminopurine (BAP) equal amount 5ml per liter . A few drops of NAA and IBA in 100ml. So it´s a 0,5milliliters (Kin,BAP) per 100ml. When jars are cooled of you moved in a clean sterilized place. Somebody uses laminar flow hood or cabinet. I use a self made glove box .I fist made for a magic mushrooms. I have daydream about it. Hmm" Own flow hood" Ok.( It´s good for mushroom inoculation). I put the jars in the sterilized glove box. I use to sterilize 70% IPA or stronger . Soak the box with alcohol and let the alcohol float in the bottom, then move the jars in the box fast and clean. This time I have been a cut the stem of pereskiopsis and put it in the 0,5%-1% bleach solution, few drops of dish soap and stirred for ten minutes , then I have rinse with distilled water and then soak in the 70% IPA and stir it a few minutes, Rinse three times with distilled, sterilized water. You don't want to contamined your product with bacteria or anything shit. You can expect some mould and bacterial growth in a few jars. Don't give up if you fuck up your first trial. Learn where your contaminations arrived. Try to void that in a next time.  There are stuff called PPM (Preservative for Plant Tissue Culture) and you can use it for a disinfect your plant and put it in a media to avoid contaminations. It´s very priced stuff and one liter can cost like 1500$. 10ml solution is about 10$. You can preservative a plant piece in 50% PPM a long time. If you are in a trip and you find a plant what you want tissue culture, Take a piece of plant and put it a PPM. This way you can save good plant tissue for a longer time.   
Now you can cut the plant in the right sized pieces with the sterilized surgical blade and tweezers. Every time you cut with surgical blade different plant or touch anything you have to sterilize it in a burning flame to red hot. Same with the tweezers!!! You must remember it always!!!  I think the right size is a approximately over one centimeter. But longer piece can product more stems. Then you put plant pieces in baby food jars and put the plastic cap on and moved in to aquarium or transparent tank. I have a 40 liter aquarium. If you have a place where sun can shine you don't need a lamp. I use a 45cm 25w fluorescent lamp (natural white light) and little pit of natural sunlight can shine in my growing chamber. I have a automatic timer to switch the lamp on and off. I have it on a twelve hour period. Ten in a morning to ten in the evening it´s on. I have a heat mat but I don't need it right now because is weather is so hot right now but in a winter time I gonna need it. The lamp gives heat also. I try to keep the temperature in 25 degree Celsius. I don´t know is this best degree. Works for me!

If you have contamination in a jar, don't throw it away. You can try to save that but don't put it in the same place of others. Quarantine . Then you can drop a few drops of 5% hydrogen peroxide and 70% IPA. Let it work a few minutes .Then pour access liquid of. I can save a few plants with this method. If you see a little bacterial growth it´s time to try save it. That don´t work if there are too much of bacteria- , mould growth. If you have PPM solution you can try it. I never try. But next time I try if a have a contamination. Somebody uses a antimicrobials such like antibiotic penicillin and other stuff. I think if you are doin this for a business then you should buy it. 
Let the jars stand in the bottom of aquarium and put the lid on and tape the corners shut whit the micropore tape and the dust mask . Now you can look what happened in there and do some notes how things goes on when time goes past .

Now the shoots have emerge and it´s growing almost over the top. Next get your tweezers and junk the plant out off the jar and put it in a sterilized plate. Now you can cut the plantlets(stem) off. Then you moved those in the new jar where are a new media and hormones. Now hormones have to be majority auxin and gibberellins to grow roots. Or you can put them in the rockwool or water to grow the roots. When all have done and plant have a roots it´s time to move in the soil. You have sterile your soil before you put the plant on it. It may have a shock for a bacteria of soil if not sterilized. Put the soil in the microwave oven and heat it hot(few minutes) and took it out and stir it and put it a gain and do it for a several time and check temperature and try to keep it over 70 decrees of Celsius for a 20-30 min or put in the pressure cooker (autoclave).
Next let the soil cooled off and then you can plant it. Now you have keep the plant in the humid place or it will shock and die. This time you can use aquarium for humid tent. Put the jar of water in there and keep it moist. You can use a clear transparent plastic jug 0,5liter and sprayed with the water everyday for a few weeks. I think is a good keep the humidity over a week and then little by little introduction on a natural air.     
Next time Im gonna document the whole thing. Take a pictures and video and sent it for you to learn it.
Here is a Pages you want to visit.


http://www.hometissueculture.org/    (you can order products in here)
http://www.phytotechlab.com/        (you can order products in here)

INFo
http://www.kitchenculturekit.com/tcinfo.htm#Training 
[url=http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/][url=http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/][url]http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/]http://www.planttissueculturemedia.com/][url]http://www.planttissueculturemedia.com/[/url]
http://www.omnisterra.com/botany/cp/slides/tc/tc.htm
http://www.quisqualis.com/tv03tc01p1.html

Nice YouTube videos:
http://www.youtube.com/watch?v=KYvJByYrSPg
I have learn a lot of this guys videos. So look and learn!!!
http://www.youtube.com/user/fbt2007

Tässä on vähän tietoa noista kasvienbiologiasta ja hormoneista.
http://mattipekkarinen.net/kasvisivut/biologia.htm


Sitten kuvia mitä olen tehnyt joskus.

[Esine69]

Näköjään kukaan ei oo jaksanut lukea tota tekstiä tai sitten pitää sitä pyhäinhäpäisynä.
Pyydän anteeks jo etukäteen ennen kun joku kommentoi jotain ikävää...
Olis ollut kiva saada keskustelua edes mitä mieltä porukka on kun kajotaan kasvien hormoneihin
ja yleensä mitä mieltä on näin rajuista kokeiluista joka on kyllä nykypäivää.
Olis kiva ku edes yksi kokeilunhaluinen tai joka tietää asiasta jotain niin alottais keskustelun.
Taitaa vaan olla sen verran raskas teksti että ei kukaan jaksa lukea.
Harmi kun en saanut mahdollisuutta kirjoittaa sitä suomeksi silloin kun kirjoitin sen.

[jaolsten]

Kyllä täällä mielenkiintoa löytyy ja onhan tästä mikrolisäyksestä ollu puhettakin. Mutta kuten itsekin totesit, raskasta tekstiä ja ainakin itsellä vaatii hieman keskittymistä että jaksaa kahlata läpi ajatuksella.

[Atheos__]

Sama teksti suomeksi niin alkaa kiinnostamaan, liikaa outoja sanoja

[Esine69]

Kai sen vois sitten jokupäivä suomentaa.
Ei se pitäis paha prokkis olla kun on jo englanniksi kirjoittanut sen ja tietää mitä siinä lukee.

[Feint]

Aika rankkaa tekstiä tuo on. Paljon on hankalia sanoja ja tuo englanti on hieman rikkonaista, ei helpota tilannetta yhtään. Suomennoksesta olisi varmasti hyötyä, eiköhän joku uskalikko tuohon mukaan lähde 

[Kärsä Babar]

Itsekkin muka aina niin kiireinen ettei jaksa ruveta lontoota lukemaan. Aihe on erittäin kiinnostava.

[PP]

Kiinnostaa minuakin. Lontoota voisi lukea, mutta outoon aiheeseen vierailla termeillä ei riitä into.

[Aku]

Tulihan tuo teksti lukaistua läpi. Kiinnostavalta vaikuttava aihe. Aikaisemminkin lukenut aiheesta ja halu tehdä muutamia kokeiluja on melko suuri. Ongelmana on tarvikkeiden huono saatavuus Suomeen / vaikea löydettävyys. Etenkin mikrolisäyksestä olisi hyötyä C. tovariin kaltaisten harvinaisten villichilien lisäämisessä.

[.:Dam:.]

Menee tuo teksti mun pääkopan yli samalla tasolla missä lentokoneet lentää  Kiinnostava aihe todellakin mutta kääntämisen sijaan jaa tieto ja taito ennemminkin vaikka päiväkirjassa kuvineen kaikkineen. Ja mieluusti aihiona joku harvinainen villichili mikä ei normikonstein tykkää juurtua.

[Esine69]

Mä aloitin tänään suomentaa tuota tekstiä ja vielä täälä kirjoittelen.
On kyllä turhan pitkä vaikka tajuaa et mitä lukee jopa itselle. Mut suomennan sen teille luettavaksi.
Mä sain tuosta idean viesteistä meinaan. Jos jollain on tosiaan jotain hullun vaikeita itään olevia villichilin siemeniä.
voisin ottaa haasteen vastaan ja aloittaa sillä pienimuotoisen projektin. Kuka tarjoaa haasteen?
JA TIETTY TEHDÄ TÄNNE RAPORTIN KUVINEEN PÄIVINEEN!

[nwldx]

Hienoa että riittää kiinnostusta suomentaa! Aihe on kuitenkin enemmän kuin mielenkiintoinen. Innolla jään odottelemaan.

[Dethlock]

Koitin lukea tuon ajatuksella läpi mutta jossain vaiheessa aivot leikkas kiinni. Mielenkiintoinen aihe muutenkin kuin pelkästään chilien kantilta mutta aavistuksen raskasta luettavaa.

[Esine69]

SUOMENNOS.

Oli kyllä eilen tosi väsynyt kun kirjoitin tätä ja nyt päivällä jatkoin sitä. En tiedä onko kauheasti typoja ja
välillä en muistanut tai tiennyt mitä joku sana suomeksi on. Toivottavasti tämä nyt selventää pikkaisen.

Tämä on tutoriaali mikrolisäykseen/ kudosviljelyyn.eli kloonaamista solukkoviljelymenetelmien avulla.
Mikroviljely on tekniikka millä kasvattaa uusia kasvia pienestä palaa kasvia.
Se voi olla tosi pieni pala kasvia tai siitepölyä. Jos haluat kasvattaa koko kasvin pienestä palasta,
esim. 1mm*1mm palasta silloin on kasvatettava kallusta. Kallus on monistettua kasvisolukkoa
joka näyttää vihreiltä ja haalean keltaisilta möykyiltä. Kallus solut on samoja soluja mikä peittää kasvin haavan.
Nuo solut on erilaistumattomia soluja niinkuin kantasolut ihmisillä. Noista soluista voi kasvattaa täysin uuden kasvin tai kasvin osan.
Niitä kutsutaan explants.(en muista suomalaista nimitystä).Ensin on kasvatettava sitä kallusta joka sen jälkeen siirretään uuteen kasvumediaan.
Silloin kalluksesta voidaan kasvattaa useita pieniä kasveja tai jakaa kallusta lisää. Tämä on kasvin kloonausta.
Sama genomi monistetaan kalluksen tai kasvien muodossa. Jos sinulla on pieni varsi kasvia niin voit tökätä sen suoraan kasvatusmediaan ja
silloin varsi kasvattaa monia varsia siitä, sitä kutsutaan "shoot" En tiedä suomenkielistä nimeä.
"Shoots" on niikun uusia syntyneitä kasvin varsia,lehtiä ja alkioita jotka on uusia kasvavia kasveja.
Varresessa olevat kasvupisteitä "silmut" (Meristem) eli solukko varressa joka on erilaistumaton mistä voi kasvaa lehtiä,kukkia,varsia ja juuria.
Erityisesti aktiivisesta "apical meristem" eli osa kasvavaa kärkea tai juurikkoa saadaan kasvatettua helposti kasveja tai juurakkoa.
ELi kun laitat kasvin kärjen suoraan kasvumediaan niin se kasvattaa itseänsä isommaksi tai voit kasvattaa pelkkää juurta ja siitä lopulta
uuden kasvin.

Minä itse tilasin kasvihormonit ja kasvúmedian Hometissueculture.org .sta nuo sivut sisältää paljon tietoa ja kasvatuspaketteja mitä voit tilata.
Ok. Mennään kasvatusmateriaaleihin. Yleensä kasvatusmedia sisältää jotain hyytelöimisainetta. itse käytän agaria siihen.
Sitten se sisältää sokeria,vitamiineja ja kasvihormoneja esim. Kinetin ja indole-3-butyric happoa(IBA) On kolme perinteistä hormoni ryhmää,
Ne on auksinit, sytokiniinit ja gibberelliinit.

Auksiinit kasvattavat juuria pääasiassa ja siksi on hyvä pistokkaille. Liika tätä niin tappaa kasvit.
Yleensä käytän auksiineja niinkuin indole-3-acetic acid(Indoli-3-etikkahappo(IAA)), indole-3-butyric acid(Indoli-3-voihappo(IBA),
1-naphtaleneacetic acid (naftaliinietikkahappo(NAA) ja sitten on Phenylacetic acid(fenyylietikkahappo(PAA). Tätä kemikaalia on sitten vaikea saada ja
siksi sitä ei käytetä kun tosi harvoi. Meinaan tämä on lähdeaine methamfetamiinille ja monelle muulle huumeelle.Siksi se on kielletty melkein joka maassa.
Sitä ei saa kun kemianlaitokset jolla on lupa käyttää sitä. Auksineita käytetään solujen jakamiseen.
Kun Auksineita ja sytokiniinejä käytetään yhtäläinen määrä niin yleensä saadaan kallusta kasvamaan.

Sytokiniinit on aine mitä haluat käyttää kloonaukseen joka edistää solujen jakautumista, juuriin ja kasveihin. Se on tärkeä komponentti kasvattaessa kallusta
ja tarvit sitä melkein kaikkialla. Sytokiniinejä on monenlaisia esim. kinetin, zeatin ja 6-benzylaminopurine(BAP). Zeatiini on kallista ja siksi en käytä sitä,
mutta ne ovat paljon vahvempa kun normaalit sytokiniinit. Varren kloonaukseen ja pikkukasvien pistokkaitten kasvuun suhde on sytokiniiniä ja
auksiinia ja auksiini on johtava hormoni mitä tarvitaan enemmän suhteessa.

Gibberelliini säätelee kasvua ja vaikuttaa moneen kehitys prosessiin,
niin kuin varren pituuteen,itämiseen,talvehtimiseen,kukkimiseen,sukupuoleen,entzyymituotantoon ja lehtien,hedelmien pitkäikäisyyteen.
Gibbereliinit on hyvä itämiselle ja pystyt idättämään siemeniä mitä on vaikea idättää Esim. Villichilit. Prosenttuaalisesti paljon korkeampi kun normaalisti.
Voit jopa nostaa itämisprosenttia 20% jopa 80%, ainoastaan sinun pitää löytää oikea suhde mitä siemenet vaatii.
gibbereliinin ja veden suhde mitataan PPM (Parts per million). Olen käyttänyt Gibberelliinihappo (Ga3) eli gibbereliini A3.sta ainoastaan siementen idätykseen laimentamalla sitä veteen
ja uittanut siemeniä sielä 10-30minuuttia. Ga3 pitää liuottaa isopropyylialkoholiin(IPA) ja sen pitää olla noin 70%-90% puhdasta tai se ei liukene.
Voit myös käyttää muita alkoholeja mutta IPA on turvallisin ja helpoin vaihtoehto hankkia. Pirtu käy ihan hyvin. Metanolikin käy mutta pitää muistaa että se on myrkky.
Sitten kun olet liuottanut ga3 alkoholiin niin sen jälkeen sen voi laimentaa vedellä. Yleensä käytetty suhde on 300-3000PPM
mutta joudut itse etsimään parhaan suhteen jokaiselle kasville erikseen. Aina voi heittää hatustaa ja kokeilla eri vaihtoehtoja.

Uskon että kaikki kasvihormonit jos ne on jauheena niin joutuu liuottamaan 70% tai puhtaampaan alkoholiin.
Sitten on vielä paljon muita kasvihormoneja ja kasvunsäätelyyn vaikuttavia aineita mitä en nyt ala mainitsemaan kun ei oo kokemusta.Enkä käytä.

Nyt sitten siihen kasvumediaan. Siihen tarvitaan hiilihydraatteja eli sokereja. Voi käyttää sakkaroosia,dextroosia,fruktoosia ja mielestäni myös glukoosia.
Kasvit tarvii hiilihydraatteja kasvaakseen niinkun kaikki elollinen kasvaessa. Yleensä olen käyttänyt 20-60 gramma per litra sokeria(sakkaroosia)
Ihan tavallista sokeria. Käytin 20g sokeria kun tein kokeita pereskiopsiksen ja salvian kanssa.

Kiintessä kasvatusmediassa on yleensä yhdistelmä epäorgaanisia suoloja ja muutama orgaaninen ravinneaine, vitamiineja.
ostin "Murashige and Skoog basal medium with vitamins" eli valmis media missä on valmiina ravinteet ja vitamiinit mitä tarvitaan.
Myynnissä on useita valmispaketteja mitä voi ostaa. Voit myös tehdä sen itse. Tarvitaan magnesium pillereitä, innositol pillereitä(vitamin B) tai muita vitamiini B
ja thiamiini(vitamiini b1) valmisteita. Noilla voi jo aloittaa mutta mielestäni vaaditaan kaikki ravinteet kasvatusmediaan. On olemassa makro ja mikro ravinteita.
makroravinteet on C,H,O,P,K,N,S,Ca,Mg(vaadittava määrä kasviin on 0.1% per kuivapaino) Mikroravinteet on Fe,Mn,Zn,Cu,B,CL,Mo(vaadittava PPM/kuivapainosta).
Jotkut kasvit tarvitsee myös Na,Se ja Si. Alkuun pääset kyllä vähemmälläkin. Eli Magnesium pilsut ja vitamiinipillerit missä on sopivasti nuita aineita.

Puhutaampa hyytelöimisaineista mitä tulee kasvatusmediaan. Niitä on Agar agar joka on yleiten käytetty kun muut hyytelöimisaineet.
Muita sitten on Agaroosi, Garrageenani ja gellanikumi. Agar on mielstäni parasta, mutta et halua käyttää mitä myydään läheisessä kiinalaisessa tai muissa aasialaisissa kaupoissa tai lähikaupoissa koska se ei oo puhdasta agaria ja siihen tarvitaan puhdasta. Jos et osta puhdasta niin voit saada kaikkea mitä et ole toivonut saavan kasvualustaasi. Jotkut asiat voi tuhota sinun kasvumedian. Liaan korkea tai matala Ph. Minaraaleja tai bakteereja mitä et halua. Siksi on hyvä kääntyä kemikaalikaupan puoleen tai tilata internetistä. Ebaystä saa nuita mutta siinä on omat huonot puolensa. Meinaan multa vietiin rahat mutta tuotetta en koskaan saanut. harmi. Yleensä kasvualustaan käytetään 6-9 grammaa agaria yhtä litraa kohden että tulee sopivan kiinteää geeliä/hyytelöä. Vähempää määrää käytetään nestetekniikassa. Minä en tiedä siitä oikeastaan mitään. Mutta tarvitset kasvualustan olevan kiinteä ja kumimainen meinaan jos tökkäät kasvin varren siihen niin ettei kaadu.
Ph. Aina pitää muistaa säätää ph joka kasvin mukaan missä ne tykkää parhaiten kasvaa. Se pitää löytää tai tietää jostain.Yleensä se on hapan tai neutraali.
Eli jos chilejä kokeilee niin sen pitäisi olla mieluiten pikkaisen hapan. Eli vaikka laittaisi ph.n 5,6-7 välille.

Seuraava vaihe on tosi tärkea. Sinun pitää tehdä kaikki steriilisti. Steriilit välineet steriili paikka. Sun pitää olla varma että kemikaalit on steriileitä.
Kaikki paikat missä toimit on sterilisoitava kloritella tai 70% alkoholilla tai puhtaammalla mutta vesi on hyväksi koska ei haihdu kun täysin puhdas alkoholi ja
siksi se vaikuttaa paremmin. Työkalut ja astiat on hyvä keittää tai vielä parempi kun painekeittimeen nakkaa 15 minuutiks. Sillon on kaikki ei toivotut varmasti kuollut. Kasvimateriaalikin on sterilisoitava mutta sitä ei keitetä. Klorite tulee yleensä 5% liuoksena kaupasta mutta se on liian vahvaa kasveille. 1% klorite liuos on hyvä. Kasvi pistetään noin 5-20minuutiksi 1%klorite liuokseen välillä sekoittaen. Aika riippuu kuinka likainen on. Myös kuinka herkäksi epäilee kasvia.
Sitten kasvi huuhdellaan tislatulla vedellä mikä on sterilisoitu mieluiten painekeittimessä tai vähintään keitetty.Sitten pala kasvia laitetaan 1-2 minuutiksi 70% alkoholiin. Sitten huuhdellaan kolme kertaa tislatulla vedellä(Akkuvesi). Sinun on keksittävä ja kokeiltava kuinka paljon kasvi kestää desinfiointia ettei kuole mutta ei tuu kontaminaatoita. Jotkut on kestävempiä kun toiset. Kokeilemalla ja epäonnistumalla selviää. Paras kohta ottaa pala kasvia on uusin ja nuorin kohta kasvia ja tietysti puhtain. Eli yleensä nuori oksa. Yritä pitää kasvi yhtenä palasena puhdistuksen ajan ja sitten kun puhdistus on tehty niin sitten sen voi leikata sopiviin paloihin.

Tavarat mitä tarvitset tähän projektiin on helppo hommata ja eikä ole kauhian kalliita. Tavarat mitä tarvitse on: Kirurginveitsi tai partakoneen terä,
Pitkät pinsetit,vauvanruokapurkkeja(mikrolisäys purkkeja),muovikorkkeja(läpinäkyviä),lautasia,painekeitin(autoklaavi), akvaario(terrario, läpinäkyvä laatikko),
mikroporeteippi(hengittävääteippiä),hanskalaatikko( laminaari virtaus kaappi), hengityssuojain, muovi ja lasipulloja, mittalaseja, ruiskuja1ml,2ml,5ml,10ml,50ml, PH-mittari(paperi),
Loisteputkilamppu(tai luonnonvalo), kattila, ajastin(ei pakko), alkoholipoltin(kaasupoltin) lämpömatto(optionaalinen),lämpömittari.

Kemikaalit mitä tarvitset:Klorite, 70-99%alkoholi(etanoli,IPA), Suolahappo, kaliumhydroksidi(KOH)(natriumhydroksidi,lipeä,NaOh),100%agar, sokeri, kasvihormonit. valmisKasvualusta(optionaalinen),
Tislattu vesi.

Nyt on tärkeimmät asiat tiedossa. Nyt tehdään kasvumediaalusta esimerkiksi pereskiopsis spatulalle. Se on kaktus. Toimi myös salvialla.en tiedä mikä on paras resepti mutta onnistuin kokeilemalla.
Ensiksi otat litran tislattua vettä ja kaadat sinne puolet "Murashige and Skoog basal medium with vitamins" valmis kasvumedian. Tän jälkeen laitetaa agar kattilaan  ja kasvuhormonit voi myös laittaa samalla.
Agarin laitetaan ensiksi ja testataan ph. mittarilla tai paperilla. Jos tarvii säätää ph.ta niin sitten kaliumhydroksilla tai suolahapolla. Etikkahappo käy myös ja taitaa myös sitrunahappo käydä
ja on paljon turvallisempaa kun suolahappo. Natriumhydroksidi käy myös mutta se on paljon vaarallisempaa kun kaliumhydroksidi. Pitää olla varuillaan noiden kemikaalian kanssa ettei mitään paskamaista käy.
Voit polttaa silmät päästä tai muuttaa ihon saippuaksi näillä. näkö lähtee jos saat näitä silmiisi.
Ok. Minä säädin ph.si 5,6. Sitten laitoin kattila levylle ja laitoin miedolle että vesi pikkuisen poreili. keitosta annetaan kiehua miedolla lämmöllä noin 5-10 minuutia jonka jälkeen jaoin sen kymmeneen 100ml osaan.
Voi myös koko satsin tehdä kerralla mutta minä halusin että saan kaikkiin osiin eri pitoisuuden kasvuhormoneja. Eli otin yhden 100ml osion .Sen jälkeen jaoin sen 100ml satsin kolmeen vauvanruokapurkkiin.
käytin 50ml ruiskua tähän että sain kaikkiin purkkeihin 33,3ml ja otin 1ml ruiskulla kasvihormonia mitä tarvitsin ja sekoitin keitoksen.Tässä vaiheessa alkaa media jämähtää purkkeihin
mutta yrittää olla sen verran nopea että saa kaiken sekoitettua. Sen jälkeen vauvanruokapurkkeihin laitoin läpinäkyvän muovikorkin päälle.Sitten kun on saanut kaikki valmiiksi
niin pistin purkit painekattilaan 15minuutiksi. Sellain saa sterilisoitua median. Sitten odottelen että purkit on jäähtynyt. Tässä vaiheessa minulla oli kymmenen satsia eri hormonipitoisuuksilla.
Tälläin huomaa että mikä on parhaiten toimiva pitoisuus. Minulle selvisi että paras suhde oli että kinetiini ja 6-benzylaminipurine(BAP) oli yhtä paljon 5ml per litra ja muutama tippaa NAA ja IBA 100ml.
Eli se on 0,5ml sataan millilitraan kinetiiniä ja Benzylaminopurea. Sitten kun purkit oli jäähtynyt niin siirsin ne steriiliin paikkaan. Jotkut käyttää niin sanottua laminar flow hoodia tai kaappia.
Minä käytin hanskalaatikkoa minkä olin tehnyt sienien kasvatusta varten. joskus unelmoin omasta "laminar flow hoodista"
Ok. Ekaks sterilisoin sen laatikon suihkuttelemalla sinne suihkepullolla 70% isopropyylialkoholia. Anna boxin lillua alkoholista ja ei haittaa vaikka laatikon pohjalla olisi alkoholia reilusti.
Tän jälkeen leikkasin perskiopsiksesta palan ja jonka laitoin 0.5-1% klorite liuokseen ja tipan tiskinpesuainetta, fairya. Sielä sekoittelin sitä noin 10 minuuttia ja otin pois ja
huuhtelin tislatulla vedella. Sitten laitoin sen kahdeksi minuutiksi 70% IPAan ja sekoittelin aika ajoin. Huuhtelin lopulta kolme kertaa kasvin sterilisoidulla vedellä. Et tosiaan halua että tulee mitään kontaminaatoita.
Voi olla että niitä tulee mutta älä luovuta. Ala luovuta vaikka kaikki menee persiilleen. Kyllä sen oppii aikanaan. Yleensä voi odottaa että muutamassa purkissa kasvaa hometta tai jotain muuta kun haluttua.
On sellaista ainetta olemassa mikä on nimeltään PPM(Preservative for Plant Tissue Culture) Tätä voidaan käyttää kasvin desinfiointiin ja säilyttämiseen. Esim jos olet ulkomailla reissussa
ja näät jonkun kauniin ja erikoisen chilin niin voi ottaa pienen palan ja säilöä tämän 50% PPM liuokseen. Tässä liuoksessa kasvin pala säilyy pitkään.
Ainoa harmi on kun se on hemmetin kallsita. Litra voi maksaa 1500$. 10ml liuosta on noin 10$ ja ei oo 100% vaan yleensä jotain 5-30%.

Palataan asiaan. Nyt kun kasvi on sterilisoitu ja kaikki sielä missä pitää olla eli hanskalaatikossa.  Nyt leikataan oikean kokosia paloja kasvista sterilisoidulla terällä ja pinseteillä.Aina kun vaihdat kasvia tai kosketat jotain terällä
Se on sterilisoitava palavalla liekillä esim. alkoholilamppu. Sama pinseteille. Tämä on muistettava aina.
Sopivan kokoinen pala leikattuna on noin 1cm mutta vähän isompi kappale voi tuottaa enemmän varsia. Laitat kasvin palan nyt vauvanruokapurkkiin korkki päälle ja sitten sinne läpinäkyvään akvaarioon.
Itsellä on 40litran akvario missä pidän nuo. Jos sinulla on paikka mihin luonnon valo paistaa niin et tarvi valaistusta. Itse käytin 45cm 25W loisteputki lamppua. (luonnon valkoinen) ja pikkuisen auringon valoa.
Minulla oli automaatti ajastin ja laitoin sen 12 tunnin jaksoihin. Eli päivällä 12h valoa ja niin edespäin... Minulla on lämmitysmatto mutta en käyttänyt sitä silloin kun oli tarpeeksi lämmintä muutenkin.
Jos on kylmät oltavat niin on hyvä käyttää lämpömattoa että kasvit kasvavat nopeammin.Yritin pitää itsellä 25C astetta, en tiedä oliko paras lämpötila mutta toimi minulla.

Jos sitten huomaat muutaman päivän päästä että purkissa on kontaminaatio eli kasvaa hometta tai jotain muuta epäilyttävää. Älä heitä sitä pois. Nyt otetaan turvakeinot käyttöön.  Älä säilytä sitä muiden joukossa vaan pistä karanteeniin. Voit laittaa muutaman tipan 5% vetyperoksidia ja 70% IPAa. Anna vaikuttaa muutaman minuutin ja kaada ylimääräiset pois purkista.  Tällä tavalla voit säästää kasvin tappamalla homeen tai bakteerit. Tuo ei kyllä auta jos on kerinnyt kasvaa iso määrä hometta tai muuta. Mitä aikaisemmin huomaat että on ongelma sitä paremmin pystyt pelastaa kasvisi.
Jos sinulla on PPM liuosta niin sillä kanssa voi yrittää korjata tilanteen. Yleensä kun tehdään oikeita kokeita kouluissa,laitoksissa tai yrityksissä niin ne käyttävät kasvualustassa erinlaisia antibiootteja  ja muita myrkkyjä bakteereja ja homeita vastaan. Jos meinaat saada suurikokoista yritystoimintaa tästä niin silloin suosittelen ostaa antibiootteja heti kättelyyn.

Itse laitoin purkit akvarioon ja pistin kannnen päälle ja kulmiin teippasin hengityssuojaimen ettei pölyt ja muut hiukkaset pääse akvarioon. Nyt on aika seurata mitä purkeissa tapahtuu ja pitää vaikka päiväkirjaa.

Nyt on purkeissa kasvanut uudet varret(shoots) ja ovat melkein korkissa kiinni. Seuraavaksi otat pinsetit ja nyppäät kasvin pois mediasta ja pistät sen sterilisoidulle lautaselle. Tämä tehdään steriilissä paikassa esim. haskalaatikossa .
Nyt voit leikata pikkukasveja(planlets) irti vanhasta rungosta ja siirtää ne uuteen kasvatusmediaan missä on uudet hormonit. Nyt hormoneiden pitää olla pääasiassa auksiineja ja gibberelliinejä kasvattaaksesi juuria. Tai vaihtoehtoisesti voit kokeilla kivivillaa tai pelkkää vettä kasvattaakseen juuria. Sitten kun uudet pikku kasvit on kasvattanut juuriaa niin on aika siirtää sen multaan. Multa pitää olla sterilisoitua ettei
kasvi saa shokkia bakteereista. Voit mullan käyttää painekeittimessä mutta myös mikrottaminen käy. Laita multa mikroon ja pistä korkein teho päälle.
Anna olla mikrossa muutaman minuutin kuumalla ja ota ulos se ja sekoita kunnolla. Pistä uudelleen mikroon ja toista tätä tapahtumaa usein noin 20-30minuuttia ja koita pitää lämpötilia kokoajan yli 70C astetta.
Lopulta kaikki bakteerit ja homeet kuolevat. Nyt odotellaan että multa viilenee että voi laittaa kasvin sinne. Sen jälkeen on kasvi suojattava läpinäkyvällä hupulla esim. Muovipussi.
Kasvi on pidettävä jatkuvasti kosteassa ilmastossa 95-100 ilmankosteus. Myös kosteassa akvaariossa voi säilyttää, Myös puolen litran muovimukia voi käyttää kunhan välillä suihkuttelee puhdasta vettä.
Olisi hyvä että viikkoon ei tarvisi tehdä mitään vaan antaa kasvin olla kosteassa ilmastossa. Ettei se saa liika bakteereja tai happea kerralla. Reilun viikon jälkeen kun näyttää että
kasvi on alkanut tottua multaan ja sitten pikkuhiljaan alkaa totuttaa sitä normaaliin ilmastoon. Päivä päivältä voi antaa olla pitempään pois kostean hupun alta esim. Ensimmäine päivä 15min,
toinen päivä 30min, kolmas päivä 1h ja niin edelleen. Seuraa vaan että kuinka se reagoi vai saako shokin. jos alkaa näyttää huonolta niin palaa ainakin puoleen missä kohtaan shokki ilmeni ja
jatka tästä kun kasvi on normalisoitunut. Itsellä ei ollut hirveää ongelmaa ja kahden viikon päästä kun olin saanut kasvin pois vauvanruokapurkista niin se oli normaalissa huoneen ilmastossa. monta uutta pikkukasvia kasvoi ruukussa. Alkuperäisesti sain joku 30-40 kasvia mutta suurin osa kuoli tässä viimeisessä vaiheessa. Eli ilmastoon totuttamisessa kun en tiennyt kuinka nopeasti voi laittaa huoneilmaan. Myös osa ei koskaan juurtunut.

Lisää linkkejä hormoneita ja toiminnasta.
http://fi.wikipedia.org/wiki/Kasvihormoni

[punkgrower]

Mahtaisiko sinulta löytyä vielä tuota Gibberelliinihappo (Ga3):sta ? Olisin halunnut tehdä sillä muutamia kokeita. Mistä sitä saa yleensakkin hankittua ja mihin hintaa?

[Herpiili]

Plants from test tubes on melko raskaslukuinen opus, mutta sisältää melko reilusti tietoa aiheesta.

[Esine69]

Mahtaisiko sinulta löytyä vielä tuota Gibberelliinihappo (Ga3):sta ? Olisin halunnut tehdä sillä muutamia kokeita. Mistä sitä saa yleensakkin hankittua ja mihin hintaa?

Kyllä sitä taitaa olla. Ei kyllä paljoa. Mitäs sä sillä meinasit.
Jos sulla on tarjota jotain kiinnostavaa chiliin ja kasvatukseen niin voidaan ehkä tehdä vaihtarit.

[Esine69]

Plants from test tubes on melko raskaslukuinen opus, mutta sisältää melko reilusti tietoa aiheesta.

Siinä on kyllä hyvää tietoa. Oon lukenut sen.

[punkgrower]

Mahtaisiko sinulta löytyä vielä tuota Gibberelliinihappo (Ga3):sta ? Olisin halunnut tehdä sillä muutamia kokeita. Mistä sitä saa yleensakkin hankittua ja mihin hintaa?

Kyllä sitä taitaa olla. Ei kyllä paljoa. Mitäs sä sillä meinasit.
Jos sulla on tarjota jotain kiinnostavaa chiliin ja kasvatukseen niin voidaan ehkä tehdä vaihtarit.

Siemenilleppä sitä olisin kokeillut ja ehkä jotain mutaatio testejäkin jos mahdollista. Minulla ei oikein ole kun eri chilien siemeniä muut kasvatus /chili systeemit on kovassa käytössä. Ehdota sinä jotain niin katon olisko mahdollista.

[Aku]

Mitenkäs tuo kasvihormoneiden tilaaminen? Tuleeko tullin kanssa jotain ongelmaa, vai saako tilailla ihan huoletta? Laitan tarvittavat hormonit tilaukseen, jos voi ongelmitta tilata IBA:a, BAP:tä ja Ga3:a. Siinä tapauksessa olisi jotakin projektipäiväkirjaakin tiedossa.

Ylellä artikkeli mikrolisäyksestä:
Mikrolisäys tuottaa terveitä kasvikopioita