chilien molekyylibiologiaa!

[cornell]

Mikä on chileille ominaisimman piirteen, tulisuuden, geneettinen tausta ja mitä siitä tiedetään? Tämä kysymys pyöri päässäni loggautuessani hakukoneelle ja kas... Viime vuonna The Plant Journalissa 42/2005 oli ilmestynyt aihetta koskeva artikkeli:

Artikkeli 1 (lue myös artikkeli 3)

The Pun1 gene for pungency in pepper encodes a putative acyltransferace

Charles Steward et al.

Kyseinen kirjoitus on muuten imuroitavissa ilmaiseksi lehden verkkosivuilta
http://www.blackwell-synergy.com/toc/tpj/42/5

Ajattelin kirjailla tähän joitain pääkohtia jutusta, jos jotakuta sattuis kiinnostamaan :roll: ... itsellekään ei ole ihan kaikki yksityiskohdat selviä.

Asiaan:

Kapsaisiini tunnistettiin chilien pääasialliseksi tulisuuden aiheuttajaksi vuonna 1876. Yhdistettä on jo kauan osattu valmistaa synteettisesti, mutta sen syntytapaa kasvissa ei täysin tunneta . Kyseessä on reaktiosarja, jonka viimeisessä vaiheessa vanillylamiini asyloidaan liitämällä siihen haarautuva rasvahappoketju. Kapsaisiinin analogien (kapsainoidit) erot löytyvät ymmärtääkseni rasvahapoketjun rakenteesta. Viimeisessä reaktion vaiheessa toimivaa entsyymiä on kutsuttu kapsaisiini syntaasiksi. Sitä ei ole kuitenkaan karakterisoitu eikä sen rakennetta tunneta. Kapsaisiinia alkaa syntyä hedelmän plasentan epidermisolukkoon n. 20 päivää kukinnan jälkeen. Kirjoittajat toteavat, että kokonaisuudessaan kapsaisiinin synteesireitistä tiedetään yllättävän vähän, kuten myös kapsaisiinin synteesiä ohjaavista geeneistä ja sen solunsisäisestä varastoinnista.

Varhaisten risteytyskokeiden perusteella on päätelty että, capsicumien tulisuus aiheutuu yhdestä dominoivasta epistaattisesta geenistä (Pun1 alleelista). Makeissa (ei-tulinen) varianteissa esiintyvä vastaava resessiivinen alleeli on pun 1, jonka täytyy siis esiintyä homozygoottina makeissa lajikkeissa.

Tämän tutkimuksen tavoite oli ensisijaisesti kartoittaa ja sekvensoida kapsaisiinisynteesiä ohjaava geeni. Työ alkoi aiheestakaiken saatavilla olevan geenitiedon keräämisellä . Aiemmissa geenikartoituksissa oli noussut esiin useampia genomin osia (lokuksia), jotka ovat mahdollisesti yhteydessä tulisuuden syntyyn. Erään näistä, kromosomissa 2, sisälsi Pun1 lokuksen. Oli kuitenkin löydettävä jotain, millä päästä käsiksi itse geeniin.

Pun 1 lokuksessa sijaitsevan geenin jäljille päästiin eräästä ns. geenikirjastosta löydetyn sekvenssipätkän avulla. Sekvenssi oli tulisen capsikumin cDNA:sta eristetty ns. EST klooni eli kopioitu osa tuntematonta, mutta tulisessa chilin hedelmässä ilmentyvää geeniä.
( Tämä geenin palanen oli jo aiemmin hybridisoitu makean ja tulisen C. annuumin F2 risteytysjäkeläistön kanssa. Tuloksena oli se, että EST klooni hybridisoitui ainoastaan tulisiin variantteihin ja samaan osaan genomia kuin Pun 1. Näiden lupaavien tulosten rohkaisemina kyseisestä geenipalasta konstruoitiin kikka kolmosen avulla täyspitkä cDNA (eli mRNA kopio). Tämä kopio siis edusti Pun 1 ssä sijaitsevan geenin transkriptiotuotetta eli mRNA:ta. Tästä oli enää lyhyt matka itse geeniin...  )

No joo... kaiken analysoinnin tuloksena Pun1 lokuksesta löytyi koodaavalta osaltaan 1897 emäsparia pitkä geeni, joka sekvenssin perusteella kuului asyltransferaasien entsyymiperheeseen. Kyseisestä perheestä on aikaisemmin löydetty useita sekundäärimetaboliassa toimivia entsyymejä. Osa näistä toimii rasvojen metaboliassa. Pun 1 lokuksesta löytynyt asyltransferaasi, joka on vastuussa kapsaisiinin synteesistä, ristittiin AT3:ksi.

Mielenkiintoista oli se, että tutkituissa makeissa varianteissa kyseinen geeni oli mutatoitunut siten, että sen alkupäässä oli 2.5 kiloemäksen deleetio, jonka johdosta geeni ei toimi! Sama deleetio voidaan löytää ainakin kahdesta tutkitusta bell -paprikasta ja makeasta jalapeenosta 'sweet 3575'. Kirjoittajat toteavat, että lajike-pedigreen perusteella k.o. mutaation käyttö jalostukseen voidaan jäljittää ainakin 300 vuoden taakse. Samalla se on ehkä tärkein/yleisin C. annuum lajikkeissa esiintyvän tulettomuuden aiheuttava mutaatio. Tämän mutaation ominaisuuden ottaminen jalostuskriteeriksi on puolestaan ainakin osavastuussa viljellyn paprikan genomisen pohjan kaventumisesta.

Kirjoittajat tekivät geenin ilmentymisanalyysejä ja pyrkivät todistamaan sekvenssoimansa geenin todella olevan kapsaisiini syntaasi, joka on tärkein yksittäinen tekijä tulisuuden kehittymisessä capsicumeihin. Pun 1 lokuksen epäiltiin ohjailevan mahdollisesti myös muiden kapsaisinoidisynteesireitin entsyymien ilmenemistä.

Että semosta... kysykää jos jokin asia kiinnostaa... tai muuta kommenttia...

[cornell]

Omia keloja:

Jos Pun 1 kontrolloi yksin kapsaisiinituotantoa, kaikki tämän geenin lamaannuttavat mutaatiot aiheuttaisivat tulettomuutta. Tämän perusteella luonnollisia tulettomia variantteja tulisi esiintyä säännöllisesti tietyllä todennäköisyydellä. Näin asia ilmeisesti onkin! Meillä on mietoa baccaa ja chinenseä ym. Suurelle osalle chilien kuluttajista moinen mutaatio no kuitenkin ei toivottu, puhumattakaan luonnon lajeista...

Mikä tekee habasta tulisemman kuin jalapeenosta, jos sama geeni löytyy kummastakin about samana versiona? Onko habassa suurempi määrä AT3 entsyymiä vai toimiiko se tehokkaammin? Miten geenin ilmenemistä kontrolloidaan?

[tknummelin]

Taitavat mennä jutut täällä vähän yli.

[JartsaP]

Niin noh, minäkin ymmärsin tuosta ehkä kolmasosan tai niillä main, mutta ei kai se tarkoita, etteikö muu voisi ymmärtää, ainakin alaa opiskelleille lienee pässinlihaa. Minusta on hienoa, että täältä löytyy tuonkin tasoista ymmärrystä, ja mikäpä olisi parempi paikka tallentaa mietteitään toistenkin chilipimahtaneiden ulottuville?

[Sauli Särkkä]

Ajatuksen kanssa kun tuon lukee läpi, ei se ole mitenkään üübergeeniteknistä. Hieman sanastoa voisi selvetää esim. Wikipediasta, niin olisi jokainen kärryillä. Asia ei ole monimutkainen, mutta termistö lienee monille vierasta.

Lokus, analoginen, plasenta, epidermis, epistaattinen geeni, resessiivinen, dominoiva, alleeli, hetero- tai homotsygoottinen, sekvenssi, cDNA, mRNA, EST-klooni, hybridisaatio, jne. Nuo kun vilkaisee Wikipediasta ja ymmärtää perustason DNA:n ja RNA:n kanssakäymisen, on jo pitkällä.

Palikkana: Pun1:n lokuksesta (paikasta kromosomissa) löytyi olennaiselta (toiminnalliselta) osaltaan 1897 emäsparia (eli pari kiloemäsparia) pitkä geeni, joka testien perusteella kuului tiettyyn entsyymiryhmään, josta AT3-nimitetty asyltransferaasi on kapsaisiinin synteesistä (=valmistuksesta) vastuussa oleva asyltransferaasi.

Makeissa lajikkeissa on ko. kohdassa mutaatio. Tämä mutaatio on n. 2500 emäsparin deleetio (=poistuma, eli niitä ei siinä siten ole, ks. mm. "Delete" -näppäin) ja aiheuttaa kapsaisiinin tuotantoon ongelmia -> ei kapsaisiinia, ei tulisuutta. Tämä mutaatio oli kenties pohjana valtaosaan ei-tulisille paprikalajikkeille.



-Sale

[cornell]

Just noin... eikä noista EST klooneista ym. tarvitse mitään tajuta... mulle ensilukemalta olennaisin sisältö oli toi makeiden lajikkeiden kapsaisiinittomuuden aiheuttavan mutaation selvittäminen ja se, että kapsaisiinin tuotanto näyttää olevan vahvasti yhden geenin ohjauksessa.... tämänkaltainen ohjaus varioi herkästi, sillä kaikki mutaatiot k.o. geeniin voivat vaikuttaakapsaisiinituotantoon... tämä on hienoa sikäli, että jalostettujen lajikkeiden geenipohjan kaventumista vastaan voidaan taistella ottamalla risteytyksiin mukaan useita eri mutaation perusteella tulettomia lajikkeita

Tutkimus ei kuitenkaan pysty juurikaan selittämään tulisten lajikkeiden keskinäisiä eroja.... mutta eiköhän selvitystyö jatku...

asyltransferaasiperheeseen kuuluu useita sekundäärimetabolian entsyymejä ja niissä esiintyy mutaatioita ja rakenteellista muuntelua...voi ainakin leikkiä ajatuksella, että AT3 on syntynyt mutaatioiden perusteella sattuman kaupalla jostain 'alkuasyltransferaasista' ja sen katalysoiman reaktion lopputuote on osoittautunut hemmetin hyväksi puolustusmolekyyliksi... niin hyväksi etteivät capsicumit tarvitse solanaceae heimossa usein tavattavia myrkyllisiä alkaloideja...

[Toivo]

Ajatuksen kanssa kun tuon lukee läpi, ei se ole mitenkään üübergeeniteknistä. Hieman sanastoa voisi selvetää esim. Wikipediasta, niin olisi jokainen kärryillä. Asia ei ole monimutkainen, mutta termistö lienee monille vierasta.

Ekaks ku luin ni ajattelin:- Mitä v*ttua tuo cornelli selittää. Mutta kun pari kertaa luin läpi, totuus on 5 kertaa, niin jotai sitten ymmärti.

[Tupakka]

Mielenkiintoinen juttu...

Kun saadaan vielä selville mikä geenissä aiheuttaa tulisuuden variaatiot, niin joku chilipää geeniteknikko voikin aikansa kuluksi väsätä sen maailman tulisimman chilin siitä samantien.

[cornell]

Onhan niitä syömäkelvottoman julmia lajikkeita olemassa jo nyt!!! :wink:

Vaan saas nähdä... capsaicin hakusanalla kun ettii tiedejuttuja, yli puolet ovat lääketieteen alaa... ilmeisesti molekyylin vaikutukset hermoston kivunviestintään ovat hottia tavaraa myös lääketieteen tutkimuksessa...

jos kapsaisiinituotantoa ruvettaisiin geenimuokkaamaan, veikkaisin, että kasveilla haluttaisiin tuottaa jotain lääkkeeksi paremmin sopivaa kapsaisiinianalogia ... hommassa on tosin omat riskinsä, joten en usko että toteutuu ...

Mulle nousee joskus semmonen mystisen yhteyden tunne, kun törmään tämmösiin kasvi- ihminen suhteisiin, jossa jokin kasvin tuottama yhdiste sopii just tiettyyn ihmisen aivojen reseptoriin ja saa kummia aikaan... minkälaisia kulttuurisia ilmiöitä chilin, viinin, hampun tai jonkin ginseng juuren ympärille onkaan syntynyt!

Toisaalta elukat ja kasvit ovat kasvaneet saman biologisen perusidean pohjalta.... ihmisen ja kasvien geeneistä n. 50 % koodaa samoja soluainaanvaihdunnan entsyymejä... 50%!

[Rolle R]

Kapsaisiinin rakentuminen vain yhden geenin koodaamana tosiaan johtaa tulettomiin kasveihin mutaation osuessa kohdalleen. Itse epäilisin omaan Kaleidoskopiini osuuneen yhden tällaisen mutaation, sillä kasvin palot ovat TÄYSIN tulettomia. Asia varmistunee kun toisen kasvin palot kypsyvät, yksi on jo muuttunut punaruskeaksi. Ellei sitten ole käynyt niin että siemenet sattuvat olemaan samasta palosta ja samoilla geeneillä.

EDIT: Ei pitäisi väsyneenä kirjoitella tänne, mutta tuli mieleen mahdollisuus että jos Fataliin kasvattelema kasvi on sattunut olemaan heterotsygootti kyseisen geenin suhteen, niin keskimäärin joka neljäs syntynyt siemen olisi homotsygootti "tulettoman" alleelin suhteen. Ts. Joka neljännestä siemenestä kasvatettu kasvi olisi täysin tuleton. Tämähän puolestaan viittaa siihen että kyseinen siemen mistä Fataliin "äitikasvi" on kasvatettu ei olisi vakaa Kaleidoskop (mukana siis ei toivottu alleeli), kenties risteytynyt jossain välissä. Täytyy huomenna ajatella uusiksi ja ehkä vielä hieman lisää, nyt nukkumaan  :wink: .

EDIT 2: Miksi enää vaivautua sotkemaan mansikoita ja habaneroja sekaisin, lyödään vain Pun1 suoraan mansikkaan ja siinä on naapurilla ihmettelemistä.

[Aji Inferno]

Mielenkiintoinen juttu...

Kun saadaan vielä selville mikä geenissä aiheuttaa tulisuuden variaatiot, niin joku chilipää geeniteknikko voikin aikansa kuluksi väsätä sen maailman tulisimman chilin siitä samantien.

No, tällä hetkellä maailman tulisimman tunnetun (!) chilin viittaa kantavat Karibian ja Bangladeshin alueen c.chinense -lajikkeet. Noista on mitattu yli 1.000.000 scovillen vahvuuksia, mikä on ruoanlaittoa ajatellen lähinnä sulaa hulluutta...

Oikeasti: jos nuo lukemat pitävät paikkansa, kukaan meistä viime chilitapaamisessa Vaasassa ei olisi voinut syödä kokonaista sellaista hedelmää. Ei ilman melkomoista oksennusta ja/tai ambulanssia... Mutta jengin kasvatuksessa on jo ainakin yksi sellainen "supermegachili" (Naga Morich), eli eiköhän tuosta saada jatkossa omiakin kokemuksia... ;-)

[cornell]

Jatkan vielä tästä aiheesta, uuden, ei niin teknisen artikkelin kanssa. Maaliskuussa 2006 ilmesty Journal of Chemical Ecology: ssä juttu:

Artikkeli 2

WHERE DID THE CHILI GET ITS SPICE? BIOGEOGRAPHY OF CAPSAININOID PRODUCTION IN ANCHESTRAL WILD CHILI SPECIES

JOSHUA J. TEWKSBURY, CARLOS MANCHEGO, DAVID C HAAK, and DOUGLAS J LEVEY

Arvon tutkijat olivat kartoittaneet vuosina 2002-2005 45 luontaisen chilipopulaation kapsaisinoidipitoisuuksia ja tulleet siihen lopputulokseen, että villit chilipopulaatiot ovat mahdollisesti luonnostaan polymorfisia tulisuuden suhteen. Eli kaikki yksilöt eivät ole tulisia vaan tulisuusasteessa esiintyy populaationsisäistä vaihtelua. Populaatiolla tarkoitetaan tässä yhteydessä luonnossa lähekkäin kasvavien yksilöiden joukkoa.

Lisäksi tulisten yksilöiden lukumäärä ja tulisten yksilöiden tulisuusaste kasvoivat populaation esiintymiskorkeuden kasvaessa siten, että korkealla (yli 900m korkeudessa) kasvavat populaatiot olivat lähes täysin tulisia ja tulisempia kuin alempana kasvavat tuliset.

Tutkimus on mielenkiintoinen, mutta rajautuu valitettavasti vain kolmeen lajiin C. chacoenseen, C. baccatumiin ja C. eximiumiin. Populaatiot kartoitettiin Lounais- Boliviassa chaco -tasangon ja sitä ympäröivien ylänköjen alueelta.

Populaatioiden polymorfisuuden perusteella kirjoittajat haastavat Steward et all. esittämän mallin kapsaisiinin tuotannosta (ensimmäinen artikkeli), väittäen ettei ko. malli päde villeillä lajeilla.     Tätä en ihan tajunnut, mutta jätetään hautumaan. Ilmeisesti kirjoittajat tarkoittivat, että tulettomia lajikkeita esiintyi liian yleisesti, jotta se olisi sattumanvaraisten mutaatioiden aikaansaannosta. Mutta jos tulettomuus -mutaatio  hyödyttää tietyssä kasvupaikassa, se yleistyy hiljalleen populaatiossa....  josta kirjoittajat  toteavatkin, että kapsaisiinipitoisuus ei ilmeisesti ole "must" chilimaailmassakaan eikä ilmeisesti anna valintaetua kaikissa habitaateissa.... wicked!

Kirjoittajat sijoittavat tutkitut lajit viiden kaikkein vanhimman chililajin joukkoon ja päättelevät, että jos tulisuus vaihtelee näin muinaisissa lajeissa, se on chilisuvun "alkuperäinen" ominaisuus. Kirjottajat seuraavat ilmeisesti Walshin ja Hootin 2001 julkaseman kloroplastien DNA -sekvenssin vertailututkimuksen tukemaa luokitusta (MCLeod et.al. 1982), jossa chacoense, baccatum ja eximium ovat maantieteellisesti laajimmalle levinneet alkuchilit. Näistä bacca olisi ehkä tovariin esiäiti ja eximium cardensiin. Cardensiin ja tovariin tulisuudesta ei ole ilmeisesti tehty systemaattista kartoitusta. Kirjoittajat antavat ymmärtää, että villeissä annuumeissa vallitseva tulisuusdominanssi olisi syntynyt vasta annuum -ryhmän erkauduttua esi -baccatumista amazonasilla...

Juu, se mikä heti iski silmään, oli että tutkimus on tehty Boliviassa ja tulokset puhuvat sen puolesta, että Bolivia on myös chilisuvun alkukoti ja chacoense alkuchili jne... eli reilusti kotiin päin vedetään... Nytten enää jaksa, jatketaan tästä   ....

[cornell]

Kaverien käsitys villilajien sukulaissuhteista eroaa ilmeisesti Mr. infernon käsityksistä... pitää lukea viitatut artikkelit joskus jos tästä sotkusta sais jonkun käsityksen.... :wink:

Alkuperänen abstrakti:

Abstract--
The biogeography of pungency in three species of wild chili in the
chaco and surrounding highland habitats of southeastern Bolivia is described.
We report that Capsicum chacoense, C. baccatum, and C. eximium are
polymorphic for production of capsaicin and its analogs, such that completely
pungent and completely nonpungent individuals co-occur in some populations.
In C. chacoense, the density of plants and the proportion of pungent
plants increased with elevation. Above 900 m, all individuals in all
populations except two were pungent; nonpungent individuals in at least one
of the two polymorphic populations were likely a result of spreading by
humans. The occurrence of pungent and nonpungent individuals in three
species of ancestral Capsicum and the geographic variation of pungency
within species suggest that production of capsaicin and its analogs entails both
costs and benefits, which shift from one locality to another. Determining the
selection pressures behind such shifts is necessary to understand the evolution
of pungency in chilies.

[Macc]

Lisäksi tulisten yksilöiden lukumäärä ja tulisten yksilöiden tulisuusaste kasvoivat populaation esiintymiskorkeuden kasvaessa siten, että korkealla (yli 900m korkeudessa) kasvavat populaatiot olivat lähes täysin tulisia ja tulisempia kuin alempana kasvavat tuliset.

...eli kokeilut hiihtäjien "alppimajojen" yhdistämiseksi kasvihuoneisiin on aloitettava heti?  

[cornell]

Pakko kiusata vielä yhdellä artikkelilla, sillä intialainen ryhmä julkaisi syyskuussa jutun, joka ilmeisesti torpedoi Stewardin (artikkeli 1)olettamuksen siitä, että Pun1 olisi kapsaisiinisyntaasia (CS) koodaava geeni.  

Artikkeli 3

Characterization of capsaicin synthase and identification of its gene (csy1) for pungency factor capsaicin in pepper (Capsicum sp.).

Prasad BC, Kumar V, Gururaj HB, Parimalan R, Giridhar P, Ravishankar GA.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Sep 5;103(36):13315-20. Epub 2006 Aug 28.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=16938870&dopt=Abstract

Eihän sillä sen väliä mikä sen kapsaisiinisyntaasia koodaavan geenin nimi on ja missä se lymyää, mutta ajattelin kuitenkin tuoda esille sen, että tuon ensimmäisen artikkelin johtopäätös lienee väärä. Pun 1 geenin koodaama AT 3 entsyymi ei ilmeisesti ole kapsaisiinisyntaasi, vaan jokin muu tulisille chileille ominainen geeni (toimii ehkä kapsaisiinin synteesireitillä?). Stewardin ja kumppanien todistusaineisto oli vahva, mutta lopullinen todistus, eli entsyymin aktiivisuuden todistaminen, puuttui. Tämä minunkin olisi pitänyt tajuta ennen kuin siitä tällä foorumilla avauduin.

Siinä missä Steward et co. lähtivät liikkeelle potentiaalisista geeneistä, intialaisryhmä lähti itse entsyymistä ja he onnistuivat eristämään kapsaisiinisyntaasin tulisen C. frutescensin hedelmästä. Eristetyn entsyymin toiminta todistettiin ja se syntetisoi kapsaisiinia sopivista lähtötuotteista koeputkiolosuhteissa.

Kyseisen entsyymin geenisekvenssi selvitettiin ja kävi ilmi, että kyseessä ei ollut pun 1 geeni. Uusi geeni nimettiin csy1:ksi. Geeni on hieman pun 1:tä pienempi ja se koodaa 981 emäsparin pituista tuotetta (jonka mukaan CS solussa rakennetaan). Geenin sekvenssin perusteella kapsaisiinisyntaasille ei löydetty sukulaisentsyymejä (hän on ainutlaatuinen). Tutkimuksessa ei ollut mukana tuletonta chiliä, eli tulettomuuden aiheuttama mutaatio jäi selvittämättä.

Tulisen frutescensin ja miedomman (mutta tulisen) annuumin csy 1geenit olivat sekvenssiltään samanlaiset eli tulisuuserot johtuvat geenin säätelystä (tai sitten ihan jostain muusta). Tulisista marjoista löytyi enemmän CS:ää koodavia mRNA kopioita kuin miedoista eli tulisissa puskissa geeni toimii tehokkaammin. Geenin säätelyalueita ei selvitelty.

Että semmosta... järisyttävää... mikäli mä oikein ymmärrän, tämän geenin tulisi olla se oikea kapsaisiinisyntaasia koodaava, sillä entsyymi on testattu... toinen juttu on se kuinka paljon muut geenit vaikuttavat kapsaisinoidien syntyyn, sillä kyllä pun 1:llä jotain tekemistä tulisuuden kanssa näyttäisi olevan...

...kysykää jos kiinnostaa... ja on epäselvää... älkääkä uskoko kaikkea mitä mä höpötän...

[Gekko]

Stewardin ja kumppanien todistusaineisto oli vahva, mutta lopullinen todistus, eli entsyymin aktiivisuuden todistaminen, puuttui. Tämä minunkin olisi pitänyt tajuta ennen kuin siitä tällä foorumilla avauduin.

Ajattelinkin heti tuon artikkelin luettuani, että nyt ei kyllä ole tämä sekvenssin synteesireitti ihan loppuun saakka mietitty...